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豬德爾塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是尼多目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒亞科(Coronavirinae)δ-冠狀病毒屬成員。該病毒于2012在中國香港首次報到，約10%的糞便樣品呈PDCoV陽性，其中對兩份糞便樣品中的PDCoV(HKU15-44和HKU15-155)進行了全基因組序列測定和分析[1]。美國于2014年2月在腹瀉仔豬和母豬的糞便中首次檢測到PDCoV，感染豬的臨床癥狀類似于豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染，表現(xiàn)為仔豬、母豬水樣腹瀉和仔豬死亡，但仔豬死亡率(30%-40%)比豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的死亡率低[2]。隨后，韓國和我國大陸也從腹瀉豬的臨床樣品中檢測到PDCoV [3-5]。本實驗室利用針對PDCoV 包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白基因的特異性引物，對2014年1月至2015年11月收集的77個豬場的232份臨床腹瀉樣品進行了RT-PCR檢測，結(jié)果表明10.34%(24/232)的樣品呈PDCoV陽性。目前，只有美國的兩個研究團隊利用豬睪丸(Swine testicular, ST)細胞、豬腎(LLC porcine kidney, LLC-PK)細胞成功分離到了兩株P(guān)DCoV，并對其致病性進行了相關(guān)研究 [6-7]。我們將PDCoV陽性樣品接種LLC-PK細胞并對其培養(yǎng)物進行細胞傳代培養(yǎng)，通過細胞病變(CPE)、RT-PCR、間接免疫熒光(IFA)和基因序列測定對傳代細胞毒進行鑒定，成功分離得到國內(nèi)首株P(guān)DCoV并將其命名為NH株，該病毒的分離對進一步研究PDCoV的致病性、致病機制、診斷試劑和疫苗研制具有重要的意義。

材料和方法

1.1 主要材料和試劑

仔豬小腸及內(nèi)容物采集自黑龍江訥河地區(qū)某豬場;胎牛血清、MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、2.5%胰酶均購自Gibco公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit購自QIAGEN公司;PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、EmeraldAmp PCR Master Mix、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司;Trans5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluro 488購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司;LLC-PK細胞、鼠抗PDCoV 纖突(S)蛋白血清均由本實驗保存和制備。

1.2 病毒分離和傳代培養(yǎng)

采用RT-PCR方法對收集的病料樣品進行檢測，將PDCoV陽性樣品和滅菌PBS按1：5的質(zhì)量體積比制成懸液，振蕩混勻后5 000 r/min，4℃離心10 min，吸取上清，0.45 µm濾器過濾，接種LLC-PK細胞單層，37℃ 5% CO2 吸附1 h后用滅菌PBS洗2遍，換維持液(含100 U/ml青霉素，100 µg/ml鏈霉素和10 µg/ml胰酶的MEM培養(yǎng)基)后繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)正常細胞對照。每天觀察細胞生長情況和CPE。經(jīng)盲傳將產(chǎn)生CPE的細胞及其上清液反復(fù)凍融3遍后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，當出現(xiàn)90%以上的CPE時，收獲病毒，并在LLC-PK細胞上連續(xù)傳代至第9代(P9)。

1.3 病毒RT-PCR鑒定

取第9代(P9)細胞培養(yǎng)液，按照說明書，用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA。取適量病毒RNA，采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA。參照GenBank中登錄的PDCoV HKU15-44 (JQ065042)株的E、M基因序列，利用Oligo 6.0設(shè)計一對特異性引物(EMU, 5'-ACCAACCAACACCGTCCTTTA-3'/EML, 5'-AGAACCACGAGACTGTAAGCA-3')。引物由哈爾濱博仕生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 µl，其中2x EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 µl，cDNA模板1µl，10 µM EMU、EML各0.5 µl，ddH2O 10.5 µl。反應(yīng)條件如下：95℃ 5 min;98 ℃ 10 s、55℃ 30 s、72℃ 60 s，35個循環(huán);72℃ 10 min。同時設(shè)病毒RNA對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將經(jīng)膠回收純化的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T中，重組質(zhì)粒由哈爾濱博仕生物科技有限公司測序。

1.4 病毒IFA鑒定

LLC-PK細胞單層感染分離病毒 18 h后棄掉上清液，以4%多聚甲醛在4℃固定30 min，經(jīng)0.2% Triton-X100在室溫作用20 min，利用5%脫脂乳封閉;以鼠抗PDCoV S蛋白血清為一抗(1:800)、山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluro 488為二抗(1:500)，進行IFA鑒定。

1.5 病毒遺傳演化分析

利用Lasergene 7.1(DNAStar)軟件包中的Editseq、MegAlignr軟件對分離株和參考病毒株的M基因序列進行分析、比對。利用MEGA 6.06軟件中的Maximum Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離株和參考病毒株之間的親緣關(guān)系。

結(jié)果

2.1 病毒的分離

將處理的PDCoV陽性樣品接種LLC-PK細胞單層進行病毒分離，觀察72h~96h。結(jié)果顯示盲傳3代后開始出現(xiàn)CPE，隨著傳代次數(shù)的增加， CPE出現(xiàn)時間逐漸縮短。通常在感染后12h~24 h出現(xiàn)CPE，主要表現(xiàn)為細胞變大、形成合胞體、脫落等現(xiàn)象(圖1)。

A: LLC-PK cells infection with P9; B: LLC-PK cells with mock infection

圖1 LLC-PK細胞感染P9后出現(xiàn)細胞病變(20 x 16)

2.2 病毒分離株的RT-PCR鑒定

利用針對PDCoV E/M基因的特異性引物對分離株P(guān)9進行RT-PCR檢測，同時以病毒RNA作為陰性對照。結(jié)果顯示得到一條約為1100 bp與預(yù)期大小一致的特異性目的片段，而且陰性對照成立(圖2)。測序結(jié)果(KU517165)為1062bp，與PDCoV參考毒株HKU15-44(JQ065042)、HKU15-155(JQ065043)的同源性分別為99.4%、99.7%。將分離株命名為NH。

圖2 NH株E和M 基因的擴增

2.3 病毒的間接免疫熒光(IFA)鑒定

以特異性的鼠抗PDCoV S蛋白血清作為檢測抗體，采用IFA方法對病毒感染的LLC-PK細胞進行IFA檢測，正常LLC-PK細胞作為對照。結(jié)果顯示病毒感染的LLC-PK細胞有特異性免疫熒光產(chǎn)生(圖3A)，而正常細胞未出現(xiàn)熒光反應(yīng) (圖3B)。

A: LLC-PK cells infection with NH strain; B: Normal LLC-PK cells

圖3 NH株感染LLC-PK細胞的IFA檢測

2.3 病毒遺傳演化分析

利用MEGA 6.06軟件中的Maximum Likelihood法對PEDV、豬傳

染性胃腸炎病毒(TGEV)、NH (P9代) 和PDCoV國內(nèi)外參考毒株的M基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明NH(紅色三角標注)和所有PDCoV參考毒株在同一群內(nèi)且親緣關(guān)系近，而與PEDV、TGEV不在同一群內(nèi)且親緣關(guān)系遠(圖4)。

圖4 NH株和參考毒株系統(tǒng)發(fā)育分析

討論

冠狀病毒能夠引起人、哺乳動物和禽類發(fā)病。國際病毒分類委員會將其分為α-冠狀病毒、β-冠狀病毒、γ-冠狀病毒和δ-冠狀病毒四個屬，其中α-冠狀病毒、β-冠狀病毒屬成員只感染人和哺乳動物，γ-冠狀病毒屬成員只感染禽類，而δ-冠狀病毒屬的成員能夠感染哺育動物(豬)和禽類，對公共安全具有潛在地威脅性。

δ-冠狀病毒是冠狀病毒家族的新成員，于2009年首次在香港的野禽中被發(fā)現(xiàn)[8]，隨后于2012年在香港的豬群中被發(fā)現(xiàn)[1]。美國自2014年2月在俄亥俄州首次發(fā)現(xiàn)PDCoV以來已經(jīng)在20多個州的豬群中發(fā)現(xiàn)PDCoV[9]。本實驗室從2014年3月起對來自不同省份的仔豬、母豬或后備公豬的腹瀉病料進行PDCoV檢測，發(fā)現(xiàn)黑龍江、遼寧、天津、山東、河北、江蘇的部分豬場存在PDCoV。此外，國內(nèi)其他研究人員也在江西、安徽、江蘇、湖北的部分豬場中發(fā)現(xiàn)PDCoV[4, 5]。

2015年初黑龍江省某豬場發(fā)生腹瀉，3份小腸內(nèi)容物送到本實驗室進行相關(guān)的病毒性腹瀉病原檢測，檢測結(jié)果表明病料呈PDCoV陽性且無PEDV, TGEV, PoRV感染。我們將陽性病料處理后接種LLC-PK細胞并連續(xù)傳代培養(yǎng)，分離得到國內(nèi)首株P(guān)DCoV，并將其命名為NH株。同時對每一代培養(yǎng)物進行RT-PCR跟蹤檢測，從P0代到P9代均能檢測到特異性的目的條帶。此外，還利用PDCoV S蛋白特異性血清對NH P9代感染的LLC-PK細胞進行了IFA，能夠看到特異性熒光; P9代的E、M基因序列與PDCoV參考毒株HKU15-44(JQ065042)、HKU15-155(JQ065043)的同源性分別為99.4%、99.7%。根據(jù)M基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明NH株與PDCoV國內(nèi)參考毒株和美國、韓國參考毒株在同一群內(nèi)。這些研究結(jié)果進一步表明我們分離到的NH株為PDCoV。

雖然目前PDCoV的檢出率沒有PEDV的高且危害沒有PEDV嚴重，但是PDCoV NH株的成功分離和鑒定對我們下一步研究其致病性、致病機制、診斷試劑開發(fā)和疫苗研制具有重要的意義。